"Análisis enzimático del veneno del escorpión cubano Rhopalurus junceus", publicado en el Journal of Venom Research en 2015

"Análisis enzimático del veneno del escorpión cubano Rhopalurus junceus", publicado en el Journal of Venom Research en 2015

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Análisis enzimático del veneno del escorpión cubano Rhopalurus junceus
Autores: Alexis Díaz-García, Jenny Laura Ruiz-Fuentes, Arianna Yglesias-Rivera, Hermis Rodríguez-Sánchez, Yanelis Riquenes Garlobo, Osmel Fleitas Martínez, José A. Fraga Castro

Afiliaciones:

Departamento de Investigación, Laboratorios de Producciones Biofarmacéuticas y Químicas (LABIOFAM), La Habana, Cuba

Departamento de Microbiología, Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”, La Habana, Cuba

Correspondencia: Alexis Díaz-García, alediaz@ipk.sld.cu

Recibido: 5 de febrero de 2015; Revisado: 22 de mayo de 2015; Aceptado: 23 de junio de 2015; Publicado: 22 de julio de 2015

Licencia: Este es un artículo de acceso abierto, publicado bajo los términos de la Licencia de Atribución No Comercial de Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0). Esta licencia permite el uso, distribución y reproducción no comercial del artículo, siempre que se reconozca adecuadamente la obra original con los detalles de citación correctos.

Resumen
El veneno del escorpión Rhopalurus junceus ha sido identificado como un extracto natural con potencial anticancerígeno. Curiosamente, este veneno no causa síntomas adversos en humanos. Sin embargo, existe escasa información sobre su composición y actividad enzimática. En este trabajo, se determinó el perfil electroforético del veneno, la actividad gelatinasa y caseinolítica, y la actividad de fosfolipasa A₂ (PLA₂) y hemolítica. También se midió el efecto de diferentes dosis de veneno (6.25, 12.5 y 25 mg/kg) en el músculo gastrocnemio mediante la actividad de CK y LDH en suero. La presencia de hialuronidasa se determinó mediante un ensayo turbidimétrico. El efecto de diferentes fracciones obtenidas por cromatografía de filtración en gel se evaluó a diferentes concentraciones (0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 mg/ml) contra células de cáncer de pulmón A549 y células normales de pulmón MRC-5 utilizando el ensayo MTT. El perfil electroforético demostró la presencia de bandas de proteínas alrededor de 67 kDa, 43 kDa, 18.4 kDa y una banda mayoritaria por debajo de 14.3 kDa. El veneno no mostró actividad caseinolítica, gelatinasa, PLA₂ ni hemolítica, incluso a la concentración más alta utilizada en el estudio. El veneno de escorpión solo mostró un efecto tóxico significativo en los músculos gastrocnemios, identificado por la liberación de CK y LDH después de la inyección subcutánea de 12.5 y 25 mg/kg. Las fracciones de bajo peso molecular (<4 kDa) indujeron una citotoxicidad significativa en las células A549, mientras que las proteínas de alto peso molecular (45–60 kDa) fueron responsables de la actividad hialuronidasa y del efecto tóxico contra MRC-5. Los experimentos indican que el veneno del escorpión Rhopalurus junceus tiene una baja actividad enzimática, lo que podría contribuir al bajo potencial tóxico de este veneno.

Palabras clave: Rhopalurus junceus, veneno de escorpión, hialuronidasa, proteínas de alto peso molecular, células cancerosas
.

Introducción
El veneno de escorpión es una mezcla de diversas sustancias activas que incluye una variedad de componentes biológicamente activos: enzimas, péptidos, nucleótidos y otras sustancias desconocidas. Las actividades biológicas de las enzimas del veneno de escorpión incluyen proteólisis, PLA₂, hialuronidasas, fosfatasas y acetilcolinesterasas. Estas enzimas contribuyen a varios cambios patológicos en la piel, células sanguíneas, sistemas cardiovascular y nervioso central, asociados a necrosis local, hemólisis intravascular y daño/fallo renal agudo. Particularmente, la PLA₂ está presente en algunas especies de escorpiones y ha demostrado ser tóxica para mamíferos, causando edema y/o hemólisis de eritrocitos de mamíferos. Las hialuronidasas generalmente tienen un efecto indirecto al aumentar la absorción de péptidos activos y permitir que los componentes tóxicos se propaguen rápidamente e induzcan reacciones sistémicas.

Rhopalurus junceus es una especie endémica de Cuba. Pertenece al género Rhopalurus, incluido en la familia Buthidae. Esta familia incluye las especies más peligrosas relacionadas con el escorpionismo humano. Sin embargo, en Cuba no hay informes de picaduras fatales de esta u otra especie en el país. Debido a esto, los escorpiones no se consideran especies médicamente importantes. Curiosamente, el veneno de R. junceus se ha convertido en un tratamiento muy popular en la medicina tradicional en Cuba para el dolor, enfermedades inflamatorias y cáncer. Algunas evidencias científicas sugieren que este escorpión tiene un efecto tóxico bajo. Sin embargo, la presencia de algunas enzimas puede estar relacionada con algún efecto tóxico y este tema ha sido raramente investigado en esta especie. En este estudio, analizamos la actividad enzimática presente en el veneno de R. junceus y la correlacionamos con la actividad biológica.

Materiales y Métodos
Reactivos

El medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) se adquirió de GIBCO/BRL (Caithersburg, MD). El suero fetal bovino (FBS) se adquirió de Hyclone. La gelatina de piel porcina, el ácido hialurónico sal sódica de cresta de gallo, la α-caseína de leche bovina, la albúmina sérica bovina fracción V (BSA), el cloruro de calcio, el tris-base y los marcadores de peso molecular para electroforesis se obtuvieron de Promega (Promega, EE. UU.). Todos los demás reactivos fueron de grado analítico y proporcionados por fuentes comerciales.

Fuente de Veneno

Los escorpiones Rhopalurus junceus se mantuvieron en jaulas plásticas individuales en los laboratorios pertenecientes a los Laboratorios de Producciones Biofarmacéuticas y Químicas (LABIOFAM). Los escorpiones mantenidos vivos en el laboratorio fueron ordeñados para la extracción de veneno una vez al mes mediante estimulación eléctrica. El veneno se disolvió en agua destilada y se centrifugó a 15,000xg durante 15 minutos. El sobrenadante se filtró con un filtro de jeringa de 0.2 µm, se congeló y almacenó a -20°C hasta su uso. El contenido de proteínas se calculó mediante el método de Lowry modificado.

Animales

Ratones machos Balb/c con un peso promedio de 20±2 g se obtuvieron del Centro Nacional para la Cría de Animales de Laboratorio (CENPALAB, La Habana, Cuba). Los ratones se alojaron en habitaciones con temperatura y humedad controladas, y se les proporcionó comida y agua ad libitum. Los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Protocolo 2013/3) y se realizaron de acuerdo con los Principios Internacionales para la Investigación Biomédica que Involucra Animales.

SDS-PAGE

Los componentes proteicos en el veneno (50 µg) se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), en condiciones no reductoras en geles de poliacrilamida al 16% (p/v). La electroforesis se realizó a 15 mA durante aproximadamente 2 horas y luego los geles se tiñeron con azul de Coomassie G-250 para la identificación de las bandas de proteínas. Se incluyeron marcadores de masa molecular en todas las corridas.

Para los ensayos de zimografía, se preparó SDS-PAGE (16%, p/v) y se co-polimerizó con gelatina o caseína (0.2%). Se corrieron 90 µg de veneno de escorpión en las condiciones anteriores. Los geles se lavaron en Triton X-100 durante 30 minutos para eliminar el SDS. Además, los geles se lavaron tres veces con Tris-HCl 0.1 M, pH 8, y se incubaron durante la noche a 37°C en un tampón de reacción (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl₂) para la zimografía de gelatina y caseína.

La actividad de fosfolipasa A₂ en el veneno se determinó utilizando el método de agarosa de yema de huevo de Habermann y Hardt. Se prepararon tres soluciones diferentes de veneno de escorpión a 1, 5 y 10 mg/ml. Cada concentración se aplicó con un volumen único de 10 µl por triplicado en cada pozo. Se aplicó extracto de anémona de mar Condylactis gigantea (1 mg/ml) a 10 µl y se utilizó como control positivo. Una zona clara alrededor del pozo de aplicación indica actividad enzimática.

Los datos cuantitativos se expresaron como media ± DE. Los datos del control positivo, veneno de escorpión y/o muestras de fracción se compararon con el control sin tratamiento utilizando la prueba U de Mann-Whitney. Los valores de CK y LDH de los ratones tratados con dosis de veneno de escorpión se compararon con los ratones no tratados utilizando

4. Resultados
El análisis electroforético del veneno de Rhopalurus junceus reveló múltiples bandas de proteínas, destacándose una banda mayoritaria por debajo de los 14.3 kDa, así como bandas adicionales a 18.4, 43 y 67 kDa. En los ensayos de zimografía con gelatina y caseína, no se observó actividad proteolítica, lo cual sugiere que el veneno carece de enzimas como metaloproteasas con actividad sobre estas proteínas.
Los ensayos de fosfolipasa A₂ (PLA₂) también resultaron negativos, ya que no se observaron halos claros de actividad en las placas con yema de huevo, incluso a concentraciones de 10 mg/ml. El control positivo (extracto de anémona) sí presentó zonas de lisis.
Tampoco se observó actividad hemolítica en eritrocitos de ratón tratados con el veneno.
En los estudios in vivo con ratones, los niveles de creatina quinasa (CK) y lactato deshidrogenasa (LDH) en suero se mantuvieron similares al grupo control en las dosis de 6.25 mg/kg. Sin embargo, a 12.5 y 25 mg/kg, se observó un aumento significativo en ambas enzimas, lo cual indica daño muscular localizado, particularmente en el músculo gastrocnemio.
La actividad hialuronidasa del veneno total fue baja, pero presente. Al separar el veneno por cromatografía de filtración en gel, se observó que la actividad hialuronidasa se asociaba con fracciones de alto peso molecular (45–60 kDa).
Finalmente, en los ensayos de citotoxicidad, se encontró que las fracciones de bajo peso molecular (<4 kDa) eran citotóxicas para las células de cáncer de pulmón A549, mientras que las fracciones de mayor peso tenían mayor efecto sobre las células normales MRC-5, lo que indica cierta selectividad antitumoral en componentes específicos del veneno.

Discusión
En este trabajo estudiamos la actividad enzimática del veneno del escorpión Rhopalurus junceus, especie endémica de Cuba. En primer lugar, fraccionamos los componentes del veneno utilizando SDS-PAGE. El perfil electroforético obtenido fue similar al de la mayoría de los venenos de escorpiones reportados previamente, en los que se ha descrito un alto contenido de proteínas de bajo peso molecular, por debajo de 14 kDa (Keskin y Koç, 2006; Borges et al., 2010; de Roodt et al., 2010; Khoobdel et al., 2013; Xu et al., 2014). Estas proteínas de bajo peso molecular (toxinas) son responsables de los principales efectos toxicológicos observados en casos de envenenamiento humano (Possani et al., 2000; Escobar et al., 2003; Velásquez y Escobar, 2004), y además, recientemente se han convertido en componentes activos de interés por su variedad de efectos farmacológicos (Ding et al., 2014).

Utilizando técnicas de zimografía, no detectamos la presencia de actividad caseinolítica ni gelatinolítica en el veneno de R. junceus, lo que sugiere la ausencia de enzimas proteolíticas. Algunos estudios han identificado actividades proteolíticas diversas en venenos de escorpiones (Almeida et al., 2002; Seyedian et al., 2010; Brazón et al., 2014; Ortiz et al., 2014). El veneno altamente tóxico del escorpión Hemiscorpius lepturus ha mostrado actividades enzimáticas como gelatinolítica y caseinolítica mediante técnicas de zimografía (Heidarpour et al., 2012). Este veneno produce múltiples efectos patológicos en la piel, células sanguíneas y sistemas cardiovascular y nervioso central (Seyedian et al., 2010), asociados con necrosis local, hemólisis intravascular y daño/fallo renal agudo, donde las enzimas están directamente implicadas (Heidarpour et al., 2012). Además, se han identificado metaloproteinasas en el género Tityus (Venancio et al., 2013; Brazón et al., 2014). En T. discrepans, se ha demostrado que las metaloproteasas y serinoproteasas son responsables de la actividad fibrinogenolítica como parte del síndrome de envenenamiento (Brazón et al., 2014), mientras que en T. serrulatus se ha descrito actividad gelatinolítica mediante zimografía (Almeida et al., 2002). Algunas de estas proteinasa están implicadas en la inducción de hipotensión y bradicardia relacionadas con las picaduras de escorpión (Venancio et al., 2013) o se sugiere que podrían sufrir modificaciones postraduccionales que activan precursores de toxinas (Almeida et al., 2002).

En nuestro estudio, no se detectó actividad de PLA₂ en el veneno de R. junceus, ni siquiera a la mayor concentración usada (10 mg/ml), y tampoco se observó efecto hemolítico en eritrocitos a 2 mg/ml. La actividad PLA₂ no está presente en todos los venenos de escorpión (Almeida et al., 2012; Venancio et al., 2013). Sin embargo, cuando esta enzima está presente, suele estar asociada a necrosis tisular, hemorragias y otros signos clínicos producidos por picaduras de animales venenosos (Valdez-Cruz et al., 2004; 2007). Ejemplos de PLA₂ aisladas son IpTxI y Phospholipin, extraídas del veneno del escorpión africano Pandinus imperator (Zamudio et al., 1997; Conde et al., 1999). IpTxI cataliza la hidrólisis de fosfolípidos, generando ácidos grasos libres y lisofosfolípidos. Se ha sugerido que estos ácidos grasos libres se unen a receptores de rianodina del retículo sarcoplásmico o a proteínas asociadas, regulando la movilización de calcio intracelular (Zamudio et al., 1997). Otra PLA₂, la Phaiodactylipina, aislada del escorpión Anuroctonus phaiodactylus, mostró efecto hemolítico directo in vitro y causó inflamación en músculo de rata in vivo (Valdez-Cruz et al., 2004), probablemente como parte del proceso de envenenamiento. Más recientemente, se ha aislado una PLA₂ del escorpión egipcio Scorpio maurus palmatus, la cual presenta actividad hemolítica en eritrocitos humanos, de conejo y de rata. Esta actividad se relaciona con su capacidad para interactuar con monocapas de fosfolípidos, de forma similar a otras fosfolipasas aisladas de venenos (Louati et al., 2013).

También se han identificado enzimas de alto peso molecular como las hialuronidasas en venenos de escorpión (Morey et al., 2006; Batista et al., 2007). Estas enzimas actúan como factores de diseminación, ya que facilitan la difusión de toxinas al catalizar la hidrólisis de glucosaminoglucanos en el tejido conectivo de la presa, lo que provoca envenenamiento sistémico (Morey et al., 2006). Los pesos moleculares reportados para estas enzimas son aproximadamente 52 kDa para Palamneus gravimanus (Morey et al., 2006), 51 kDa para Tityus serrulatus (Pessini et al., 2001) y 44.8 kDa para Tityus stigmurus (Batista et al., 2007). Estudios previos con R. junceus ya habían reportado actividad hialuronidasa mediante zimografía en bandas alrededor de 45 kDa (Rodríguez-Ravelo et al., 2013). En nuestro estudio, la actividad hialuronidasa se observó en la fracción FI, obtenida por filtración en gel, que correspondía a un peso molecular entre 45 y 60 kDa, coincidiendo con los valores reportados. La inyección intramuscular de veneno en el músculo gastrocnemio provocó un aumento significativo de las enzimas LDH y CK en suero, pero solo a las dosis más altas (12,5 y 25 mg/kg). Hasta donde sabemos, estas dosis no se han probado en estudios previos con otros escorpiones, lo que sugiere un potencial tóxico bajo del veneno de R. junceus. Además, la fracción FI fue responsable de la mayor toxicidad sobre células normales, probablemente debido a la hialuronidasa. Sin embargo, se requieren más experimentos para confirmar esta hipótesis y establecer la relación entre la hialuronidasa y el daño muscular.

Las fracciones de bajo peso molecular (FIV y FV) del veneno mostraron una citotoxicidad significativa y selectiva contra la línea celular de cáncer de pulmón A549. Estudios recientes han investigado los efectos biológicos de los polipéptidos de bajo peso molecular (PESV) del escorpión Buthus martensii karsh (BMK), los cuales constituyen los principales componentes activos de este veneno (Zhang et al., 2009; Li et al., 2014). Estos polipéptidos, con 50–60 aminoácidos, también han demostrado actividad antitumoral contra el crecimiento de sarcoma S180 y carcinoma hepatocelular H22 en ratones (Li et al., 2014). Estas observaciones refuerzan la relevancia farmacológica de las proteínas de bajo peso molecular presentes en los venenos de escorpión.

En conclusión, el veneno del escorpión Rhopalurus junceus no presenta actividades proteolíticas ni de fosfolipasa A₂, lo que constituye una característica importante, ya que contribuye a explicar el bajo potencial tóxico de esta especie. La actividad hialuronidasa podría ser, al menos en parte, responsable de la toxicidad observada, tanto en experimentos in vivo como in vitro. El efecto selectivo contra células cancerosas se encuentra principalmente en las fracciones de bajo peso molecular, lo cual podría representar el primer paso para identificar los componentes activos puros presentes en este veneno.



Agradecimientos

Los autores agradecen a sus colegas del Departamento de Soporte Técnico y Científico del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” por su apoyo en el mantenimiento de los cultivos celulares.

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